Escudo de la República de Colombia

Servicio de Secuenciación y Análisis Molecular – SSiGMOL

ANTECEDENTES 2018 -2

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El Servicio de Secuenciación y Análisis Molecular –SSiGMol, surgió en el segundo semestre del año 2009, como resultado de la coincidencia del trabajo y los intereses de diferentes Grupos e Investigadores del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia.

Durante el 2010 se estandarizaron y consolidaron los protocolos para la recepción, almacenamiento y procesamiento de muestras.

Desde el año 2011, ofrecemos el servicio de secuenciación automática de ADN por electroforesis capilar y tipificación de fragmentos así como asesoría científica personalizada para usuarios que requieran de orientación para la inclusión de este tipo de datos en sus proyectos de investigación.

Procesamos muestras de ADNs clonados (plásmidos, BACs, etc.) y productos de amplificación por PCR, ofreciendo resultados confiables y de alta calidad, acorde con las necesidades de la comunidad colombiana científica, académica, gubernamental y/o privada, en cuanto a precios, tiempos, resultados y soporte.

Trabajamos para que SSiGMol sea reconocido a nivel nacional como líder en la prestación del servicio de secuenciación de ADN, contando con la capacidad humana e infraestructura suficientes para entregar resultados confiables, con agilidad y a bajo costo.

SERVICIOS

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– Secuenciación de ADN Automatizada

El Servicio de Secuenciación y Análisis Molecular Instituto de Genética – SSiGMol ofrece servicios de análisis de secuenciación que son rápidos, económicos y confiables. Las muestras son procesadas empleando la química del BigDye Terminator de ABI (el método del  dideoxi o Sanger) y son corridas en un Analizador Genético Applied Biosystems 3500 con capacidad de lectura de secuencia de aproximadamente 1,000 pares de bases.

La secuenciación Sanger utiliza la terminación específica con cuatro fluorocromos diferentes que permite la realización de secuenciación en una reacción.  Este método, que es el principal en la secuenciación automatizada, es el más exacto y definitivo para identificar variación genética; y las plataformas capilares de electroforesis de Applied Biosystems son el estándar industrial, proporcionando la tecnología más confiable, más eficiente, y extensamente
publicada para el análisis de secuencias de ADN.

El Analizador Genético ABI 3500, en combinación con los kits de Applied Biosystems BigDye® Cycle Sequencing ofrece más automatización, mejor desempeño, comodidad y control de calidad de los datos. Los algoritmos de análisis que conforman los módulos de corrida para el equipo están optimizados en rapidez, precisión y reproducibilidad. Además, módulos de secuenciación han sido desarrollados específicamente para las muestras preparadas con el kit de purificación de BigDye® XTerminator™, proporcionando una mejor calidad de las secuencias.

Para garantizar reproducibilidad y control de calidad, SSiGMol incluye un control positivo que se procesa simultáneamente con las muestras de los usuarios, que garantizan tanto la reacción de secuencia como la calidad de la electroforesis capilar.

– Análisis de Fragmentos para Microsatélites, Genotipificación, SNPs y Otros

SSiGMol ofrece servicios de análisis de fragmentos marcados con fluorocromos generados por PCR. Las muestras son corridas en un Analizador Genético Applied Biosystems 3500. Dentro de este servicio se incluyen: microsatélites, análisis de single nucleotide polymorphisms (SNPs), polimorfismos en longitud de fragmentos amplificados (AFLPs) y polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP).

El servicio de análisis de fragmentos involucra la electroforesis capilar de productos de amplificación marcados con fluorocromos. El Analizador Genético Applied Biosystems 3500, ofrece hasta cinco fluorocromos distintos para el marcaje, permitiendo mayores niveles de combinación de marcadores para el análisis de fragmentos en multiplex, bajando los costos por muestra. Un estándar de peso molecular incluido con cada muestra, marcado con un sexto fluorocromo, proporciona  una determinación de tamaños precisos y reproducibles, y además elimina problemas asociados con la variación en la migración en la electroforesis entre las corridas.

SSiGMol tiene disponible los siguientes filtros:

– DS-33 (Dye Set G5): fluorocromos 6-FAM, VIC, NED y PET® con LIZ peso molecular para AmpFlSTR Identifiler® Kit, AmpFlSTR Yfiler™ Amplification kits, Custom Oligos, LMS v2.5, Mouse Mapping Primers, StockMarks Kits

– DS-02 (Dye Set E5): fluorocromos dR110, dR6G, dTAMRA™, dROX™ con LIZ peso molecular para kits de SNaPshot®, Primer Focus®, SNaPshot Multiplex Kits

– DS-30 (Dye set D): fluorocromos 6-FAM, HEX, NED, ROX

– DS-30 (Dye set C): fluorocromos 6-FAM, TET, HEX, TAMRA
SSiGMol ofrece tres estándares de peso molecular (Size Standards) disponibles de acuerdo al tipo de marcador y las necesidades de sus usuarios:

– GeneScan LIZ-120 Size Standard (9 fragmentos entre 15 y 120 nucleótidos)

– GeneScan LIZ-600 Size Standard (36 fragmentos entre 20 y 600 nucleótidos)

– GeneScan LIZ-1200 Size Standard (68 fragmentos entre 20 y 1200 nucleótidos)

OTROS SERVICIOS

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– Soporte Técnico

Junto con nuestros servicios de secuenciación y de análisis de fragmentos, y de manera gratuita, disponemos de horarios de atención en los que discutimos con nuestros Usuarios los problemas particulares asociados a sus proyectos, brindando nuestra experiencia en la resolución de los problemas técnicos que se presenten, de modo que nuestros Usuarios mejoren sus procesos de laboratorio y obtengan productos de PCR que permitan generar secuencias y fragmentos de excelente calidad.

– Asesoría Científica
Este servicio consiste en el trabajo conjunto entre nuestro equipo y los Usuarios para el diseño y la planeación de metodologías específicas que permitan estudiar problemas de interés (por ejemplo diseño de primers, diseño de multiplex, estandarización de protocolos de amplificación o purificación…), así como la interpretación y el análisis de resultados obtenidos (por ejemplo uso de programas de alineamiento. El servicio de asesoría científica no incluye la realización de procedimientos de laboratorio por parte de SSiGMol.
Para acceder a este servicio envíe un correo electrónico a solicitssigmol@unal.edu.co Especifique cual es su interés respecto al servicio de asesoría científica, cuál es el requerimiento particular en el que le interesa que SSiGMol lo apoye, de igual manera procure brindar toda la información que considere necesaria para que podamos sugerir el procedimiento más adecuado de asesoría. Luego de la comunicación por correo electrónico le citaremos a una primera reunión donde se aclararan los diferentes parámetros del servicio, esta primera cita no tiene costo, a partir de ella las reuniones que se realicen como parte de la asesoría tienen el costo correspondiente a lo establecido entre SSiGMol y el Usuario.

INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS

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De la adecuada preparación de sus muestras depende la calidad de sus resultados, por favor lea con cuidado y completamente esta sección. No se recibirán muestras que no cumplan con las especificaciones de preparación y entrega establecidas.

SSiGMol recibe muestras en tubo o placa.

– Tubos : Utilice microtubos de 1.5mL. (No recibimos ni muestras ni primers en tubos de PCR de 0.2mL). Marque sus tubos de forma clara y legible en la tapa y el costado.

– Placas : Utilice placas de 96 pozos de 0.2mL.

Prepare la placa verticalmente por columnas, como se muestra a continuación.

 

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No deje pozos sin muestra en las columnas, ni prepare la placa horizontalmente por filas de 12 muestras. La placa debe cubrirse adecuadamente (con mantas adhesivas o tiras de tapas). SSiGMol no se responsabilizará por el material de los usuarios y la contaminación cruzada que pudiera ser ocasionada en el transporte si las placas no se cubren de manera adecuada.

TIPOS DE MUESTRAS

1- PRODUCTOS DE PCR PARA PURIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN:

El éxito de la purificación de productos depende críticamente de la calidad de la amplificación. En el momento solo ofrecemos el servicio de purificación a partir de productos de PCR. Si el producto amplificado presenta una alta cantidad de dímeros de primers o amplificaciones inespecíficas NO garantizamos los resultados.

Solicitud de servicio e información asociada
Para acceder al servicio de purificación a partir de productos de PCR es necesario que junto con la solicitud del servicio envíe la siguiente información:

– Imagen clara del gel de agarosa en el que se comprobó la amplificación de las muestras.
– Nombre de cada una de las muestras en cada carril de la imagen.
– Porcentaje de preparación del gel, tiempo de corrido y voltaje.
– Sistema de tinción utilizado (Ejemplo. SYBR®Safe)
– Volumen de la muestra cargado en el gel y tamaño esperado del fragmento amplificado.
– Volumen del marcador de peso molecular (MPM) utilizado y referencia (Ejemplo. 1Kb Plus DNA Ladder Invitrogen No. Cat 10787-018). Le recomendamos el uso de MPM diseñados para la cuantificación de ADN.

Una vez nos haya enviado esta información le confirmaremos cuales de sus productos recomendamos para ser purificados por nuestro Servicio. Si lo quiere, puede enviar a purificar productos que nosotros no recomendemos, sin embargo SSiGMol NO se hace responsable por la calidad de los resultados de la secuenciación.

Preparación de las muestras para purificar

Envíe 45µl de producto de PCR. En otro(s) tubo(s) independientemente envíe el volumen de primer(s) que se requiere considerando que por muestra debe entregar 1,5uL. Sin embargo, el mínimo volumen de primer que debe entregar es 5,0µL. La concentración del primer debe ser 10µM. Recuerde que si usted no envía sus muestras y sus primers a la concentración adecuada no podremos garantizar la calidad de sus resultados.

Si usted requiere secuenciar una muestra con dos primers (forward y reverse) envíe SOLO UNA muestra para purificar, a partir de esta realizamos la secuenciación con ambos primers. Recuerde que en este caso el cobro se hace por una purificación y dos secuencias.

 

2- PRODUCTOS PARA SECUENCIAR

El éxito de la reacción de secuenciación de ADN depende críticamente de tener muestras de alta pureza en la concentración adecuada, entre otros factores.

Al purificar sus muestras tenga en cuenta:
Para Plásmidos utilice un kit comercial que le proporcione una pureza constante del ADN del plásmido para secuenciación.

Para productos de PCR, estos deben estar libres de posibles inhibidores, primers o dNTPs no incorporados. Productos no purificados, o purificados de manera inadecuada o ineficiente no son apropiados para ser secuenciados. Le recomendamos visualizar su producto purificado en un gel de agarosa para confirmar la ausencia de productos inespecíficos.

Envíe sus muestras de ADN resuspendidas en AGUA ULTRAPURA. Recomendamos NO utilizar TE para diluir o resuspender las muestras ya que el EDTA inhibe la reacción de secuencia. Recuerde que los buffers de elución de los kits de purificación generalmente contienen EDTA.

Preparación de las muestras para secuenciar

Prepare 10µl de muestra purificada de acuerdo a las concentraciones especificadas en la siguiente tabla. Adicione 1.2 µl del primer respectivo, cuya concentración inicial debe ser 10µM. El volumen final (muestra + primer) será de 11.2 µl siendo la concentración final del primer de 1.07 µM. Recuerde que si usted no envía sus muestras y sus primers a la concentración adecuada la calidad de sus resultados puede verse comprometida.

El laboratorio recomienda tener en cuenta las concentraciones que aparecen en la tabla 1, de acuerdo con los tamaños de los amplificados. Tenga en cuenta que las concentraciones de la tabla corresponden a los valores mínimos en los cuales debe estar su muestra para ser viable para secuenciar, usted puede entregar sus muestras hasta al doble de la concentración descrita sin afectar la secuenciación.

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Primers de secuenciación

Los primers que usted agregue a la muestra deben estar resuspendidos en AGUA ULTRA PURA, libres de sales, EDTA, o de otros posibles inhibidores. Es importante que tenga en cuenta que sus primers cumplan con las siguientes características ya que de esto dependerá la calidad y longitud de sus secuencias:
-Longitud de 17-25 bases.
-Contenido del GC% entre el 40% y el 60%.
-Tm (temperatura de anillamiento) entre 53°C y 58°C.

No siempre los primers que usted emplea para amplificar sirven también para secuenciar. En especial, primers con posiciones degeneradas ocasionan inconvenientes en la secuenciación. Por lo anterior le recomendamos que si requiere utilizar primers de amplificación con posiciones degeneradas, les añada una “cola” con una secuencia de primers universales de secuenciación (como M13).

SSiGMol ofrece sin costo adicional los siguientes primers universales para secuenciar. En caso de que usted solicite que SSiGMol suministre los primers, envíe sus muestras al volumen y concentración recomendadas.

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3- FRAGMENTOS (AFLPS, MICROSATÉLITES, SNPS)

El éxito del análisis de fragmentos depende críticamente de tener concentraciones correctas y condiciones óptimas del producto en el caso de amplificaciones en multiplex.

Preparación de las muestras

Preparare 10µl de muestra debidamente diluida resuspendida en AGUA ULTRA PURA.

Existe una alta probabilidad de que usted tenga que realizar diluciones de sus productos de amplificación antes de enviarlos al servicio. La dilución requerida depende del tamaño del (los) fragmento(s) y su intensidad. Es importante entender que comparar intensidades de fragmentos de diferentes tamaños en un gel de agarosa no es comparable con el proceso de detección en el secuenciador dado que en gel de agarosa detectamos la cantidad de ADN mientras que en el secuenciador detectamos número de moléculas/fragmentos (en un gel de agarosa 100 fragmentos de 1000 pb es igual de intenso que 1000 fragmentos de 100 pb, mientras que en el secuenciador no lo es).

Flurocromos

Para la realización de análisis de fragmentos fluoromarcados es importante tener en cuenta la compatibilidad de diferentes fluorocromos. La única combinación de fluorocromos que permite el marcaje y detección de cuatro (4) fluorocromos (sin contar el LIZ® Size Standard) es PET, 6FAM, NED y VIC. Si usted no tiene experiencia en el análisis de fragmentos le recomendamos que acceda previamente a nuestro servicio de Asesoría Científica para poder garantizar la calidad de sus resultados.

– NOTA IMPORTANTE

Le recomendamos realizar la optimización de la migración de sus fragmentos en nuestro equipo antes del envío masivo de muestras.

ENVÍO DE MUESTRAS

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Si usted entrega personalmente sus muestras a SSiGMol o las envía por correo, por favor tenga en cuenta lo siguiente:

-Solo se reciben muestras en los horarios establecidos de lunes a jueves de 9 am a 3 pm. En caso de muestras enviadas por correo, organice su envío para que las muestras lleguen al Instituto de Genética preferiblemente en los horarios establecidos.

-Solo se reciben muestras que cumplan con las condiciones de preparación indicadas en este instructivo. Si usted envía sus muestras por correo, y no cumplen con las condiciones de preparación NO las procesaremos. Nos pondremos en contacto con usted para definir el procedimiento a seguir.

-Las muestras se reciben con el formato de solicitud de servicio debidamente diligenciado. Es necesario traer una copia del formato, que firmaremos como recibido y que entregaremos a la persona que entregue las muestras. (Este formato se encuentra disponible en PDF, adjunto a este instructivo). Si usted envía sus muestras por correo, envíelas junto con el formato de solicitud de servicio. Le recomendamos quedarse con una copia del formato de solicitud de servicio diligenciado.

-Para el envío de muestras en tubo, verifique que han sido tapados adecuadamente. Recomendamos colocar los tubos en una sola bolsa con cerrado hermético.

-Para muestras el envío de muestras en placa, por favor verifique con cuidado que hayan sido cubiertas adecuadamente y que el sistema que usted utiliza para cubrirlas evita los derrames. Le recomendamos colocarlas en una bolsa con cierre hermético.

-Sus muestras pueden permanecer a temperatura ambiente por un tiempo (24 horas), por lo que no es necesario utilizar métodos para mantener las muestras frías, sin embargo, si usted considera que son muestras especialmente susceptibles a la degradación, por favor utilice geles refrigerantes al interior de las bolsas de cierre hermético. Por favor evite el uso de hielo corriente y de neveras de icopor.

ENTREGA DE RESULTADOS

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Los resultados del procesamiento de sus muestras se entregaran vía correo electrónico de 4 a 7 días hábiles contados a partir del siguiente día hábil de la recepción de las muestras en el laboratorio. Este tiempo depende fundamentalmente de la cantidad de muestras recibidas. Siempre procesamos las muestras en orden de llegada.

 

Entrega de Resultados de Secuenciación

Los resultados en SSiGMol se disponen como cromatógramas (*.ab1), archivos que se puede leer con programas como BioEdit Sequence Alignment Editor y Chromas (para Windows), Geospiza FinchTV (para MAC o Windows), estos programas corresponden a software libre.

Recuerde que el resultado de la secuenciación es el cromatograma. También enviamos un archivo correspondiente al control positivo que se corre junto con las muestras en la reacción de secuenciación, en la purificación y en la electroforesis capilar.

Como parte de nuestra política, realizamos la revisión de todas las secuencias obtenidas. En caso de que sus muestras generen secuencias con problemas y sugieran un tipo claro de causa (secuencia mezclada, exceso de DNA, poco DNA, etc) se lo haremos saber junto con sus resultados.
Entrega de Resultados de análisis de fragmentos

Los resultados en SSiGMol se disponen como cromatógramas (*.fsa), archivos que se puede leer solamente con el programa GeneMapper ver. 4.1. Dada la complejidad de asignar genotipos, SSiGMol no realiza análisis de los datos automáticos. En cambio, ofrecemos acceso al programa de manera presencial o por acceso remoto, en horario que se acordará con el personal de soporte técnico. Se aclara que SSiGMol no tiene permitido disponer la copia o reproducción de programa GeneMapper versión 4.1.

Applied Biosystems dispone del software libre Peak Scanner Software que es de uso fácil y permite leer, editar, analizar, imprimir y exportar datos de análisis de fragmentos generados por los equipos de Applied Biosystems.

Los archivos .fsa de análisis de fragmentos consisten en el cromatograma de sus muestras y del LIZ® Size Standard adicionado por nosotros. El LIZ se considera el control positivo de la electroforesis capilar y como parte de nuestro servicio, este control positivo, se revisa en cada uno de los archivos de análisis de fragmentos que generamos.

GARANTIAS Y OTRAS POLITICAS

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GARANTIAS

De acuerdo a nuestra política de Gestión de Calidad, como servicio, en SSiGMol garantizamos:

La seguridad y confidencialidad de toda la información compartida entre el Usuario y SSiGMol.

La seguridad y confidencialidad las muestras físicas recibidas por SSiGMol de acuerdo a los procedimientos establecidos.

La seguridad y confidencialidad de los resultados obtenidos.

La calidad de los resultados de todas las muestras que cumplan con las condiciones de preparación que se establecen en esta guía.

SSiGMol no utilizará ni la información, ni las muestras físicas, ni los resultados obtenidos para ningún fin diferente al establecido con el Usuario.

 

OTRAS POLÍTICAS

A partir del día de entrega de resultados, mantenemos las muestras almacenadas por un periodo de un (1)  mes. Luego de este periodo todas las muestras son desechadas.

A partir del día de entrega de resultados, mantenemos una copia digital de los archivos de resultados enviados por un periodo de seis (6) meses. Luego de este periodo los resultados son borrados.

En SSiGMol estamos dispuestos a desarrollar nuevos servicios de acuerdo a las necesidades de nuestros Usuarios, sin embargo, SSiGMol se reserva el derecho a decidir su participación y las condiciones bajo las cuales se realizaran los nuevos desarrollos.

En SSiGMol no nos responsabilizamos por demoras en los procesos debido a la desinformación de nuestros Usuarios, dado que los diferentes procedimientos prara la preparación de las muestras para su envío están descritos en el item “INSTRUCCIONES PARA LA PREPARACIÓN Y ENVÍO DE MUESTRAS” de esta página web.

 

COMO USUARIO DE SSiGMol Y/O RESPONSABLE EN LA ENTREGA DE MUESTRAS, USTED ACEPTA HABER LEÍDO LA PRESENTE INFORMACIÓN Y REALIZAR LOS DIFERENTES PROCESOS DEL SERVICIO COMO AQUÍ SE ENCUENTRAN ESTABLECIDOS.

CONTÁCTENOS

Enlace a PQR sugerencias y reclamos.

 

También nos pueden contactar al siguiente correo electrónico, para información asociada a sus procesos tanto de muestras como administrativos:   solicitssigmol@unal.edu.co

O comuníquese con nosotros:

Servicio de Secuenciación y Análisis Molecular-SSiGMol
Instituto de Genética – Universidad Nacional de Colombia sede Bogotá
Carrera 30 No. 45 – 03. Entrada calle 53.
Edificio 426, Oficina 103 Laboratorio No. 5
Bogotá D. C. – Colombia

Teléfono (571) 3165000.

Laboratorio No. 5 : Ext. 11636

Oficina Administrativa: Ext. 11604

Horario de Lunes a Viernes de 8:00 am a 4:00 pm

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